JC-1 Набор для анализа потенциала митохондриальных мембран

 

название продукта	Идентификация продукта	модель
JC-1 Набор для анализа потенциала митохондриальных мембран	G1515-100T	100T

 

 

JC-1 представляет собой катионный карбонилцианиновый краситель, который может проходить через клеточную мембрану и агрегировать по направлению к митохондриям под действием потенциала митохондриальной мембраны. Это идеальный флуоресцентный зонд, широко используемый для определения потенциала митохондриальной мембраны. Когда потенциал митохондриальной мембраны высок, краситель агрегирует в матриксе митохондрий, демонстрируя красную флуоресценцию (Ex=585 нм, Em=590 нм); Когда потенциал митохондриальной мембраны низкий, JC{{3 }} представляет собой преимущественно мономер, существующий в цитоплазме и демонстрирующий зеленую флуоресценцию (Ex=514 нм, Em=529 нм). Следовательно, изменение О мембранном потенциале митохондрий можно судить по трансформации цвета флуоресценции и изменению пропорций, а снижение мембранного потенциала митохондрий также является важным маркером раннего апоптоза.

Набор для анализа потенциала митохондриальной мембраны JC-1 основан на флуоресцентном зонде JC-1, который позволил решить проблему легкого осаждения и устранить другие недостатки. Этот набор можно использовать для быстрого и чувствительного обнаружения изменений потенциала митохондриальной мембраны в клетке или очищенных митохондрий для определения раннего апоптоза, а также является распространенным методом, используемым для обнаружения раннего апоптоза клеток. С помощью этого набора можно протестировать в общей сложности 100 6-образцы луночных планшетов.

Кроме того, в этот набор также входит реагент CCCP (карбонилцианид 3-хлорфенилгидразон), переносчик протонов (ионофор водорода) и развязывающее средство окислительного фосфорилирования в митохондриях, что может способствовать изменению проницаемости митохондрий для ионов водорода, что приводит к снижение или потеря потенциала митохондриальной мембраны, что можно использовать в качестве положительного контроля для индукции снижения мембранный потенциал митохондрий.

 

 

Краситель JC-1 (500×) следует хранить при температуре -20, высушивать и защищать от света, избегать повторного замораживания и оттаивания;

Буфер JC-1 и разбавитель JC-1 можно хранить при температуре 4 градуса. Действителен в течение 12 месяцев.

 

 

Номер компонента	Компонент	G1515-100T
G1515-1	Краситель JC-1(500 ×)	4 x 50 μL
G1515-2	JC-1 буфер (10 x)	50 мл
G1515-3	JC-1 разбавитель	100 мл
G1515-4	CCCP (100 мМ)	50 μL
Руководство		1 шт.

 

 

1. приготовьте рабочий раствор красителя JC-1 (2x) и буфера JC-1 (1x):

а. Возьмите 2 мкл раствора JC-1 (500×) и 900 мкл раствора для разведения JC-1 и хорошо перемешайте, затем добавьте 100 мкл буфера JC-1 (10×) и хорошо перемешайте. путем встряхивания и встряхивания приготовьте рабочий раствор JC-1 для запасного использования (приготовьте этот раствор по порядку);

б. Возьмите необходимое количество буфера JC-1 (10×), разбавленного деионизированной водой, чтобы приготовить 1 буфер JC-1, и отложите (1 буфер JC-1 используется для последующих этапов). например, стирка, если не указано иное).

2. подготовьте положительный контроль (необязательно):

а. Возьмите соответствующее количество CCCP (100 мМ) и разбавьте в 1000 раз средой для культуры клеток, чтобы получить 100 мкМ рабочего раствора CCCP;

б. Инкубируйте клетки с рабочим раствором CCCP в течение примерно 30 минут, а затем следуйте приведенной ниже процедуре окрашивания JC-1, чтобы определить мембранный потенциал митохондрий.

Примечание. Для большинства клеток после обработки вышеуказанными методами лечения, по сравнению с нормальной группой, можно увидеть, что JC-1 существует в основном в цитоплазме в виде мономеров после индукции обработкой CCCP, демонстрируя более яркую зеленую флуоресценцию и более слабую красная флуоресценция; Однако для некоторых клеток концентрация и время инкубации CCCP могут отличаться. Обратитесь к справочнику или проведите эксперимент, чтобы найти оптимальные условия.

3. Окрашивание клеток и анализ.

а. Возьмите 1-6 × 105 клеток, центрифугируйте при 1000 g в течение 3-5 мин, чтобы удалить исходную среду, добавьте буфер JC-1 и промойте один раз, затем центрифугируйте, чтобы удалить буфер JC-1. и ресуспендируют в 500 мкл среды для культивирования клеток (можно включить сыворотку и феноловый красный);

б. Затем добавьте 500 мкл рабочего раствора JC-1 и инкубируйте в CO2-инкубаторе в течение 15-30 мин (обычно достаточно 20 мин, или время инкубации можно регулировать в зависимости от ситуации), защищенном от света;

в. В конце инкубации клетки по-прежнему обрабатывали как обычные суспензионные клетки, и после центрифугирования для удаления рабочего раствора JC-1 клетки дважды промывали буфером JC-1;

д. После ресуспендирования в соответствующем количестве буфера JC-1 (1×) или раствора клеточной культуры (рекомендуется не содержать фенолового красного) его наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа или лазерного конфокального микроскопа или анализировали с помощью проточной цитометрии и других инструментов.

4. Операция окрашивания адгезивных клеток (например, 6-луночный планшет):

Что касается прикрепившихся клеток, если их необходимо обнаружить с помощью проточной цитометрии, клетки можно сначала собрать, ресуспендировать, а затем отправить на анализ суспензионных клеток.

а. После удаления исходной среды для культуры клеток, содержащей лекарства или другие методы лечения, добавьте 1 мл буфера JC-1 и промойте 1-2 раз;

б. Добавьте 1 мл среды для культивирования клеток (может содержать сыворотку и феноловый красный);

в. Добавьте 1 мл рабочего раствора JC-1, осторожно встряхните, чтобы хорошо перемешать, и инкубируйте в течение 15-30 мин в CO2-инкубаторе, защищенном от света;

д. В конце инкубации супернатант отсасывали и дважды промывали буфером JC-1;

е. Добавьте 2 мл буфера JC-1 (1×) или раствора для культуры клеток (рекомендуется не содержать фенолового красного);

ф. Наблюдают под флуоресцентным микроскопом или лазерным конфокальным микроскопом или анализируют с помощью такого инструмента, как проточный цитометр.

5. Для извлечения очищенных митохондрий.

а. К 900 мкл рабочего раствора JC-1 добавляли 100 мкл общего белка, что составляло 10-100 мкг очищенных митохондрий;

б. После смешивания его сканировали и обнаруживали с помощью такого инструмента, как флуоресцентный спектрофотометр (с длиной волны возбуждения 485 нм и длиной волны излучения 590 нм) или прибор для мечения ферментов (когда длину волны возбуждения нельзя было установить на 485 нм, длина волны возбуждения может быть установлена ​​в диапазоне 475-520 нм), или ее можно наблюдать с помощью флуоресценции или лазерной конфокальной микроскопии, которую можно обнаружить по отношению к длине волны настройка на шаге 6.

6. Обнаружение и анализ флуоресценции.

а. Параметры длины волны для обнаружения мономера JC-1: Ex=490 нм, Em=525 нм; параметры длины волны для полимера JC-1 составляют Ex=525 нм, Em=590 нм; обратите внимание, что здесь нет необходимости устанавливать возбуждение и излучение на максимальных длинах волн возбуждения и излучения при определении флуоресценции, и что настройки параметров можно регулировать в соответствии с ситуацией вокруг этого параметра;

б. При съемке с помощью флуоресцентного микроскопа рекомендуется использовать нормальную группу в качестве стандарта для определения времени экспозиции красной и зеленой флуоресценции, чтобы эффект красной флуоресценции нормальной группы был четким, а эффект зеленой флуоресценции был темнее, и фотографировать флуоресценцию группы обработки с выдержкой времени для красной и зеленой флуоресценции нормальной группы соответственно;

4. Оценка результатов: состояние клетки нормальное, в основном проявляется красная флуоресценция, что указывает на нормальный мембранный потенциал митохондрий; если наблюдается значительное увеличение зеленой флуоресценции, что указывает на снижение потенциала митохондриальной мембраны, что может быть на ранней стадии апоптоза.

 

 

1. Для полного растворения JC-1 соблюдайте последовательность действий по приготовлению рабочего раствора JC-1.

2. Рекомендуется тестировать образцы в течение 30 минут после инкубации JC-1.

3. Раствор JC-1, буфер JC-1 (10×) можно растворить в соответствующей теплой бане, если образуется осаждение.

4. Для окончательного анализа JC-1 рекомендуется использовать раствор культуры клеток, не содержащий фенолового красного, чтобы избежать интерференции цвета фона, а феноловый красный на стадии инкубации окрашивания JC-1 не влияет на результаты. .

5. Если за один раз используется меньшее количество раствора JC-1, что может потребовать многократного повторного замораживания и оттаивания, дозируйте его соответствующим образом и старайтесь избегать многократного повторного замораживания и оттаивания раствора JC-1.

6. Во время работы надевайте лабораторный халат и одноразовые перчатки.

 

Только для исследовательского использования!

 

 

горячая этикетка : jc-1 набор для анализа митохондриального мембранного потенциала, Китай jc-1 набор для анализа митохондриального мембранного потенциала производители, поставщики, завод