Click-iT EdU-647 Набор для анализа пролиферации клеток

 

Название продукта	Кот. Нет	Спец.
Click-iT EdU-647 Набор для анализа пролиферации клеток	G1604	100 T

 

 

Анализ способности клеток к пролиферации является распространенным и важным методом оценки в науках о жизни. Он может судить о влиянии определенных генов, лекарств и т. д. на клетки, культивируемые in vitro, или анализировать способность роста и обновления клеток ткани в различных условиях или стимуляции. В настоящее время существует множество методов обнаружения пролиферации клеток. Большинство из них используют некоторые метаболические ферменты, вырабатываемые клетками, для косвенной оценки активности пролиферации клеток (например, метод CCK-8, метод МТТ и т. д.), но некоторые лекарства или состояние самой клетки будут оказывать определенное влияние на результаты оценки. Прямое обнаружение синтеза ДНК в клетках для определения пролиферации клеток признано наиболее точным и эффективным методом обнаружения. Однако как оригинальный метод включения радиомеченных нуклеозидов, так и последующее усовершенствование метода BrdU, основанное на обнаружении антител, имеют свои ограничения.

 

EdU (5-Этинил-2'-дезоксиуридин, 5-этинил-2'-дезоксиуридин) представляет собой аналог тимидина, содержащий ацетиленовую группу, при введении животным или инкубационных клетках, культивируемых в vitro эти небольшие молекулы могут быстро диффундировать в различные органы и ткани, проникать в клетки и заменять тимидин (Т) во вновь синтезированной ДНК во время клеточной пролиферации. Ацетиленовая группа в молекуле EdU может реагировать с флуоресцентно меченным iF488 зондом азидного соединения с образованием стабильного триазольного кольца под действием ионов меди, поэтому вновь синтезированная ДНК может быть помечена соответствующим флуоресцентным зондом. По сравнению с методом включения радиоактивно меченых нуклеозидов метод обнаружения EdU не имеет ограничивающих факторов, таких как радиоактивное загрязнение; По сравнению с методом обнаружения BrdU, метод обнаружения EdU не требует денатурации ДНК или реакции антиген-антитело, что значительно снижает сложность эксперимента, а также делает эксперимент более экономящим время, более чувствительным, более стабильным и более точным.

 

Этот набор можно использовать для обнаружения пролиферации клеток в культивируемых клетках или тканях животных. Флуоресцентный зонд в этом наборе имеет розовую (дальнюю инфракрасную) флуоресценцию, максимальная длина волны возбуждения составляет 656 нм, а максимальная длина волны излучения — 670 нм. После того, как пролиферирующие клетки будут помечены, ядро ​​клетки будет показывать ярко-розовую (дальнюю инфракрасную) флуоресценцию, а ядро ​​клетки будет совместно помечено соответствующим обычным ядерным красителем (в этот набор входит клеточный ядерный краситель Hoechst 33342), вы можете использовать флуоресцентный микроскоп. , лазерный конфокальный микроскоп и другие инструменты для непосредственного наблюдения за пролиферацией клеток; Вы также можете использовать проточную цитометрию для определения интенсивности флуоресценции культивируемых клеток in vitro, а затем определить клеточный цикл на основе интенсивности флуоресценции активности репликации ДНК в середине S-фазы.

 

 

Корабль с мокрым льдом; хранить при -20 градусах в темноте. Катализатор (реагент А) и реакционный буфер можно хранить при температуре 4 градуса; Действителен в течение 12 месяцев.

 

 

Номер компонента	Компонент	G1604-100T
G1604-1	Исходный раствор EdU (10 мМ)	100 μL
G1604-2	Катализатор (Реагент А)	120 μL
G1604-3	Флуоресцентный краситель iF647 (реагент B)	50 μL
G1604-4	Каталитическая добавка (реагент C)	2×100 мг (порошок)
G1604-5	Реакционный буфер	20 мл
G1604-6	Hoechst 33342 Морилка	30 μL
Руководство		Одна копия

 

Примечание. Указанное выше время реакции соответствует 96-детектированию луночного планшета.

 

Прежде чем начать

1. Среда для культивирования клеток, содержащая сыворотку;

2. Буфер пермеабилизации: буфер, содержащий 0.2-0.5% Triton X-100 (рекомендуется G1204);

3. Фиксатор: 4% параформальдегид (рекомендуется G1101) или другие подобные реагенты;

4. Буфер PBS (рекомендуется G4202);

5. Сверхчистая вода;

6. Реагенты для моделирования животных и срезов тканей (обнаружение пролиферации клеток тканей животных).

 

 

1. Предварительная обработка культивируемых клеток in vitro:

1.1. Посадите клетки равномерно в пластину для культуры клеток с определенной плотностью (плотность посадки определяется такими факторами, как размер клеток, скорость роста и т. д.). После того, как клетки прикрепятся к стенке или вернутся в нормальное состояние, выполните соответствующую медикаментозную стимуляцию и другие методы лечения. (Для суспензионных клеток следуйте обычному методу работы суспензионных клеток. Весь эксперимент должен включать центрифугирование и другие этапы).

1.2. Каталитическую добавку (Реагент С) центрифугировали на низкой скорости, отбирали 100 мг и растворяли, добавляя 1 мл сверхчистой воды, распределяли и хранили при -20 степени, оставшийся порошок хранили в качестве резерва.

2. Маркировка, фиксация и пермеабилизация EdU в клетках in vitro:

2.1. Приготовьте рабочий раствор для инкубации 2 × EdU: добавьте 2 мкл раствора для хранения EdU (10 мМ) к каждому 1 мл полной среды для культивирования клеток, что составляет 20 мкМ рабочего раствора для инкубации 2 × EdU, и поместите его в инкубатор для предварительного нагрева (рекомендуется Рабочая концентрация EdU – 10 мкМ для предварительных экспериментов);

2.2. В режиме полузамены аспирируйте половину исходной среды для культивирования клеток в культуральную пластинку, добавьте равный объем предварительно нагретого рабочего раствора для инкубации 2 × EdU и инкубируйте в течение определенного периода времени (продолжительность инкубации обычно зависит от на цикл роста соответствующих клеток, который обычно составляет около 10% клеточного цикла. Для большинства прикрепившихся и быстрорастущих клеток рекомендуется инкубация в течение примерно 2 часов. В особых случаях это необходимо. корректируется с учетом характеристик клеток, фактической ситуации после лечения и т. д. Если требуется более длительное время инкубации, рабочую концентрацию EdU можно соответствующим образом снизить на более короткое время, концентрацию EdU можно соответствующим образом увеличить;

2.3. После инкубации EdU промойте буфером PBS 1-2 раз, добавьте фиксирующую жидкость, чтобы покрыть клетки, и зафиксируйте при комнатной температуре в течение 15 минут (если требуется проточная цитометрия, перед этим шагом прикрепившиеся клетки следует переварить и ресуспендировать). исправить, следовать методу обработки суспензионных клеток); Промывайте 2-3 раз буфером PBS, каждый раз 3-5 мин;

2.4. Удалите буфер PBS, добавьте раствор для пермеабилизации, чтобы покрыть клетки, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут;

2.5. Удалите раствор, повышающий пермеабилизацию, промойте 1-2 раз буфером PBS, каждый раз 3-5 мин. Затем перейдите к шагу 4.

3. Инъекционное моделирование EdU животных, а также обработка срезов тканей:

3.1. В соответствии с экспериментальными требованиями для моделирования животных используют одну или несколько инъекций EdU путем внутрибрюшинной инъекции, внутримышечной инъекции, подкожной инъекции, инъекции в хвостовую вену и т. д. Обычно соотношение дозы EdU к массе тела животного составляет 5 мг/кг, фактическое значение доза инъекции зависит от содержания исследования и условий содержания животных. Решение для хранения EdU, входящее в этот набор, в основном используется для маркировки EdU клеток in vitro. Если вам нужно смоделировать животное с помощью EdU, вы можете заказать реагент EdU отдельно (Кат. номер: G5059);

3.2. Эпителиальные клетки, такие как тонкая кишка, пролиферируют быстро, тогда как клетки головного мозга пролиферируют медленно. Для мечения быстрорастущих тканей обычно требуется менее 12 часов, а для мечения медленно растущих тканей может потребоваться несколько дней. Оптимальное время мечения определялось в соответствии с конкретным экспериментом. Из-за быстрого разрастания эпителиальной ткани кишечника такая ткань была рекомендована в качестве эталона для маркировки.

3.3. После забоя животного в соответствии с установленными стандартами необходимые ткани извлекают и делают замороженные или парафиновые срезы по общепринятым процедурам:

а. Для замороженных срезов: верните срезы к комнатной температуре, добавьте необходимое количество фиксирующей жидкости и зафиксируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Удалите фиксирующую жидкость и промойте 3 раза буфером PBS по 3-5 мин каждый; удалите буфер PBS, покройте ткань соответствующим количеством раствора для пермеабилизации и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10-15 мин; удалите пермеабилизирующий раствор и промойте буфером PBS 1- 2 раз, каждый раз 3-5 мин. Затем перейдите к шагу 4.

б. Для парафиновых срезов: депарафинизировать и регидратировать срезы, промыть PBS в течение 5 мин. Удалите буфер PBS, добавьте раствор для пермеабилизации, чтобы покрыть клетки или ткани, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут; Затем промойте буфером PBS 1-2 раз, каждый раз в течение 3-5 мин. Затем перейдите к шагу 4.

4. Реакция щелчка EdU:

4.1. При фиксации и перфорации клеток или тканей, приготовлении реакционного раствора: смешайте реагенты в следующем соотношении, объем препарата можно увеличить или уменьшить пропорционально количеству образцов.

 

Компонент	Объем (для ячейки)	Объем (для гистологического раздела)
реакционный буфер	935 μL	928 μL
Реагент А	10 μL	10 μL
Реагент B (краситель iF647)	5 μL	12 μL
Реагент С	50 μL	50 μL
общая мощность	1000 μL	1000 μL

 

4.2. Удалите буфер PBS из клеток или срезов, добавьте реакционный раствор, осторожно встряхните, чтобы реакционный раствор покрыл все клетки или ткани, и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте;

4.3. Удалить реакционный раствор, промыть 2-3 раз буфером PBS, каждый раз 3-5 мин (если нет других специальных требований, интенсивность флуоресценции можно определить с помощью проточной цитометрии или эффект флуоресценции можно обнаружить с помощью другие инструменты).

5. Ядерное пятно (по желанию):

5.1. Разбавьте раствор для окрашивания Hoechst 33342 буфером PBS в соотношении 1:500-1000, добавьте к образцу, чтобы покрыть клетки, и инкубируйте в течение 5 минут;

5.2. Удалите красящий раствор Hoechst 33342, промойте 2-3 раз буфером PBS, каждый раз 3-5 мин.

6. Анализ визуализации и обнаружения:

Используйте флуоресцентный или конфокальный микроскоп для обнаружения обработанных клеток или образцов срезов тканей и анализа доли пролиферирующих клеток. В качестве альтернативы можно собрать клетки, культивированные in vitro, и измерить интенсивность флуоресценции с помощью проточной цитометрии (рекомендуется использовать образцы клеток, не меченные EdU, в качестве отрицательного контроля для анализа проточной цитометрии и выбирать подходящее напряжение). по интенсивности флуоресценции можно определить активность репликации ДНК S-фазы клеточного цикла. Флуоресцентный краситель iF647 (реагент B) в этом наборе соответствует спектральной характеристике Ex/Em: 656 нм/670 нм (розовый); Окрашивающий раствор Hoechst 33342 соответствует спектральной характеристике Ex/Em: 346 нм/460 нм (синий).

 

 

1. Для культивируемых клеток конкретную концентрацию EdU и время инкубации можно соответствующим образом регулировать в зависимости от образца и цели исследования.

2. Некоторые клетки тканей пролиферируют медленно. Чтобы избежать плохого эффекта моделирования, в качестве эталонных образцов рекомендуется выбирать образцы тканей с быстрой пролиферацией (например, ткань кишечника).

3. Если цвет фона слишком темный, это может быть вызвано недостаточной промывкой, длительной фиксацией, остатками фиксатора и т. д. в эксперименте.

4. Реагент C (реагент каталитического присоединения EdU) легко окисляется. Старайтесь избегать длительного пребывания на воздухе. После приготовления водного раствора рекомендуется хранить аликвотами; Протестировано, например, цвет реагента каталитической добавки EdU незначительно меняется, каталитическая система реакции щелчка все еще может работать нормально. Если реагент C выглядит коричневым, это указывает на то, что срок годности компонента истек, поэтому выбросьте его.

5. Для вашего здоровья и безопасности во время работы надевайте лабораторные халаты и перчатки.

 

Только для исследовательского использования!

 

 

горячая этикетка : click-it edu-647 набор для анализа пролиферации клеток, Китай набор для анализа пролиферации клеток click-it edu-647 производители, поставщики, завод